用cas9技术制作小鼠模型的10个必要考虑
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用cas9技术制作小鼠模型是近年来革命性的新技术。以下是我们总结出的使用此技术做小鼠模型的10个基本步骤。

制作小鼠模型再也不需要挣扎和苦恼的等待啦!

南京大学模式动物研究所的黄行许教授最早使用Cas9技术实现在小鼠大鼠及猴(全球首只敲除小鼠和敲除猴)进行建立基因打靶。黄老师利用同种技术进行三基因多位点敲除的项目也已于 2013年3月10日获得founder鼠,相关论文已完成并被知名学术杂志Cell Research接收并已于5月发表。目前模式所使用cas9技术成功获得F0代全身性敲除小鼠仅需45天,成功获得F0代条件性敲除小鼠仅需75天。

用cas9技术进行基因编辑的时候需要做什么呢?

  • 通过设计位点特异性的guide RNA来最大程度的降低脱靶问题。有一些免费的软件可以帮助你设计和评估目标靶点。比如:  http://www.e-crisp.org/E-CRISP/index.html     http://crispr.mit.edu/
  • 合成并且纯化出具有DNA核酸内切酶活性的cas9 mRNA和特异性guide RNAs
  • 如果你计划做一个敲入模型需要纯化出donor DNA
  • 选择合适基因的背景小鼠进行超排获得可用的单细胞胚胎随后进行体外受精(不是所有的小鼠都合适做超排)
  • 将mRNAs(donor DNA)显微注射进入胚胎
  • 将胚胎培养到囊胚阶段(3.5天)
  • 制作假孕鼠
  • 将培养好的囊胚转移到假孕鼠体中
  • 小鼠出生后,founder鼠需要做基因鉴定确保cas9基因编辑成功
  • 繁育阳性的founder鼠确保基因突变是可遗传的